Langsung ke konten utama

ANALISIS EKSPRESI GEN SECARA REAL TIME PCR (QPCR) DAN SEMI KUANTITATIF

 

ANALISIS EKSPRESI GEN SECARA REAL TIME PCR (QPCR) DAN SEMI KUANTITATIF

            Ikan memiliki gen yang diekspresikan secara konstitutif pada seluruh atau beberapa jenis sel dan gen yang diekspresikan berbeda-beda bergantung pada kondisi yang dihadapi organisme. Ekspresi gen tersebut secara molekuler dapat dideteksi pada tahap transkripsi (mRNA) maupun translasi protein. Penggunaan PCR atau Polymerase Chain Reaction di lingkungan akuakultur telah banyak dilakukan. Metode PCR yang paling umum dikenal yaitu secara konvensional, namun terdapat juga metode PCR yang dinilai lebih akurat dalam mendeteksi suatu penyakit atau kekerabatan di lingkungan akuakultur yang disebut dengan Real-time PCR atau quantitative PCR (QPCR) dan semi kuantitatif (Dima et al. 2015).

qPCR merupakan metode yang sensitiv untuk mendeteksi dan mengukur kualitas mRNA. Qpcr dapat diartikan sebagai teknis PCR yang mampu mendeteksi dan menyajikan perkembangan rekasi PCR secara kontinyu (real time) sehingga jumlah DNA dapat dihitung secara kuantitatif. Prinsip kerja qpcr yakni mendeteksi dan mengkuantifikasi berdasarkan keberadaan reporter fluorescens. Sinyal fluorescens akan meningkat seiring dengan pertambahan ampliko atau produk PCR dalam reaksi yang berhubungan dengan jumlah inisiasi gen target. Semakin tinggi tingkat ekspresi gen target maka semakin cepat deteksi emisi fluoresen terjadi. Jenis reporter fluoreaencena yang umum digunakan yakni Taqman dan Sybr green (Rahardianti dan Nur 2017). Kelebihan real time PCR (Qpcr) antara lain memiliki sensitivitas dan spesifitas yang tinggi, waktu pengerjaan yang lebih singkat, dan mampu mendeteksi banyak sampel dalam waktu yang bersamaan. Metode ini juga memiliki kekurangan yakni harga alat dan reagen yang mahal serta memerlukan skill yang tinggi (Rojas et al. 2019).

 Analisis ekspresi gen menggunakan real time PCR pengamatan hasil pada saat reaksi berlangsung, keberadaan DNA hasil amplifikasi dapat diamati pada grafik yang muncul sebagai hasil akumulasi fluoresens dari probe (penanda). Reaksi selama fase eksponensial dapat dipantau dengan mencatat jumlah emisi fluoresen pada setiap  siklus. Peningkatan hasil amplifikasi PCR pada fase eksponensial berhubungan dengan jumlah inisiasi target gen. Makin tinggi tingkat ekspresi target gen maka deteksi emisi fluoresen makin cepat terjadi. Kuantitas urutan DNA target dicapai dengan menentukan jumlah siklus amplifikasi. Jumlah siklus amplifikasi diperlukan untuk menghasilkan produk PCR berdasarkan fluoresensi di awal fase eksponensial PCR serta untuk melewati garis ambang fluoresensi/siklus threshold (Ct). Siklus Ct adalah 1prinsip dasar dari PCR real time dan sebagai bagian yang sangat penting untuk memperoleh data yang akurat. Nilai Ct PCR real time sangat berkorelasi dengan kuantitas urutan DNA target (Hewajuli dan Dharmayanti 2014). Penerapan qPCR dibidang akuakultur telah banyak dilakukan diantaranya analisis ekspresi gen pertumbuhan ikan, efisiensi pakan, analisis pengaruh lingkungan serta meningkatkan ketahanan terhadap penyakit (Yuvarajan et al.2019). Adapun contoh ikan yang telah dianalisis ekspresi gen nya menggunakan qPCR antara lain ikan Halibut, Rainbow trout dan freshwater pearl mussel (Kockmarek et al. 2019). 

            Semikuantitatif RT-PCR merupakan metode PCR dengan prinsip kerja menggunakan jumlah siklus untuk mengamplifikasi fragmen DNA. Kelebihan dari metode semikuantitatif RT-PCR yakni ekonomis karena tidak memerlukan  biaya yang terlalu mahal, efektif digunakan dalam 20-28 siklus dan dapat mengeluarkan hasil yang cepat apabila ketelitian tinggi. Kekurangan dari metode semikuantitatif RT-PCR yakni tidak otomatis, harus mencari siklus yang tepat (time cost), rendah sensitifitass (tidak dapat membedakan jumlah RNA<50 copy dan melalui banyak proses pasca PCR (mempengaruhi kualitas dan jumlah amplikon) (Maryati et al. 2017).

 

DAFTAR PUSTAKA

Dima AOM, Solihin DD, Manalu W, Boediono A. 2015. Profil ekspresi gen determinasi seks, bioreproduksi, fenotipe, dan performa lokomotori penyu lekang (Lepidochelys olivacea) yang diinduksi pada suhu inkubasi berbeda. Jurnal Ilmu dan Teknologi Kelautan Tropis. 7(1): 143-155.

Hewajuli DA, Dharmayanti NLPI. 2014. Perkembangan teknologi reverese transcriptase-  Polymerase Chain Reaction dalam mengidentifikasi Genom Avian Influenza dan  Newcastle Diseases. Wartazoa. 24(1): 16-29.

Kocmarek AL, Moira MF, Roy G. 2014. Differential gene expression in small and large rainbow     trout from two seasonal spawning group. Genomics. 15(57): 1-9.

Maryati H, Sudarto, Nurjasmi R. 2017. Deteksi penyakit WSSV (White Spot Syndrome Virus) pada    udang vannamei (Litopenaeus vannamei) dengan metode PCR konvensional dan real time PCR (QPCR) menggunakan hydrolysis probe. Jurnal Ilmiah Respati. 8(1): 1-10.

Rahardianti R, Nur EM. 2017. Akurasi metode real pcr untuk analisa ekspresi gen PmVRP15. Di    dalam: Balai Besar Perikanan Budidaya Air Payau Situbondo, editor. Prosiding Pertemuan  Teknis Teknisi Litkayasa Lingkup BBPBAP Jepara. 2016; Jepara, Indonesia. Jepara (ID):    BBPBAP Jepara. Hlm 1-166.

Rojas HN, Veliz D, Vega RC. 2019. Selection of suitable reference gene expression analysis gills and liver of sih under feld pollution conditions. Scientific Report. 9(1):1-8.

Komentar

Posting Komentar

Postingan populer dari blog ini

Manfaat dan bahaya sayur bayam

        Sayur adalah pangan yang kaya akan zat gizi seperti vitamin,mineral,serat,dan antioksidan. Karena kandungan gizinya yang tinggi, para dokter dan ahli gizi di seluruh dunia menganjurkan masyarakat untuk mengkonsumsi sayuran secara rutin. Selain itu banyak penelitian yang membuktian bahwa mengkonsumsi sayur secara rutin memiliki banyak manfaat bagi kesehatan.    Namun, perlu diketahui bahwa ternyata sayur bayam juga memiliki bahaya bagi kesehatan tubuh lho! 1. SEJARAH SAYUR BAYAM      Sayuran yang memiliki nama ilmiah Amaranthus sp . ini dianggap sebagai raja sayuran karena kandungan gizinya yang tinggi. Bayam berasal dari Amerika Selatan dan Tengah. Bermula dari suku asli meksiko,Aztec,yang telah membudidayakan bayam berjuta tahun lalu. Dikalangan suku tersebut Bayam merupakan tanaman yang penting dari bagian kebudayaan mereka. Bahkan, mereka membuat patung-patung dewa dari adonan bayam,yang akhirnya akan dimakan. Bukan hanya i...
Posting Komentar
Baca selengkapnya

CARA MENDAPATKAN SERTIFIKAT GRATIS DI MASA PANDEMI

 Hai teman-teman,      Pandemi Covid-19 yang belum kunjung mereda membuat banyak masyarakat jenuh. Keterbatasan untuk mengakses hal-hal baru juga hanya bisa dilakukan dirumah melalui online. Keinginan untuk meningkatkan prestasi juga sulit dilakukan diluar rumah.     Terkadang kita sering merasa down  karena melihat prestasi teman-teman kita yang terus berkembang meskipun di masa pandemi. Tidak sedikit mereka mendapatkan E-Certificate . Daripada menghabiskan waktu untuk hal-hal yang tidak berguna, lebih baik kita meningkatkan kemampuan diri kita di masa pandemi. "Hmmm, pasti bayar nih!"     NO!  Sertifikat ini bisa kalian dapatkan dengan gratis lho! Berikut daftar website untuk mengasah kemampuan teman-teman dan mendapatkan sertifikat gratis! 1) Microsoft 365  Teman-teman bisa kunjungi  link berikut untuk mendapatkan sertifikat gratisnya:  Caranya mudah banget, teman-teman cukup mendaftar menggunakan email teman-teman. Se...
1 komentar
Baca selengkapnya

GAYA REMAJA MASA KINI

PENGERTIAN Gaya hidup merupakan gambaran bagi setiap orang yang menggambarkan seberapa besar nilai moralorang tersebut dalam masyarakat di sekitarnya dan bagaimana cara orang tersebut hidup. Sebagian besar remaja zaman sekarang itu menyalahgunakan gaya hidupnya, apalagi remaja-remaja yang hidup di kota metropolitan. Dan bukan hanya orang-orang di kota metropolitan saja yang mengikuti trend mode di zaman sekarang dahkan di perkampungan dan pedesaan pun banyak yang mengikutinya selagi mereka menanggapi hal itu dengan negatif. Remaja zaman kini itu selalu dikaitkan dengan teknologi. Banyak di sekitar kita wanita yang memakai celana pendek di depan umum yang di ajarkan dalam ajaran islam yaitu harus menutup aurat kecuali telapak tangan dan muka bagi seorang wanita yang beragama islam. Sebagian besar mereka lebih mengikuti trendmode di masa kini, seperti contohnya berpakain seperti orang luar negeri dan bergaya kebarat-baratan. Yang kita tahu bahwa trend mode yang ada di luar negeri itu ...
1 komentar
Baca selengkapnya