KLONING GEN
Istilah
kloning berasal dari kata “clone” yang artinya potongan. Kloning gen dapat
diartikan sebagai suatu proses yang digunakan untuk memanipulasi DNA dan
kemudian dikembalikan pada organisme hidup untuk diekspresikan. Teknologi ini
memampukan untuk mengisolasi DNA tertentu dari genom suatu organisme hidup,
kemudian mentransformasinya menggunakan vektor pada suatu inang tau dalam
pengertian lain kloning gen merupakan proses penggabungan gen target ke
dalam molekul DNA yang dapat bereplikasi
sendiri (vector) dan proses amplifikasi menghasilkan DNA rekombinan pada sel
inang yang sesuai (Mishra et al. 2014). Prinsip kloning DNA/gen yaitu
memasukkan suatu DNA/gen tertentu ke dalam vector yang dapat bereplikasi
sendiri di dalam sel inang (bakteri/kapang) sehingga menghasilkan kopi DNA/gen
yang identik (Yatera et al. 2021). Kloning gen memiliki keterkaitan
dengan DNA rekombinan. Proses DNA rekombinan meliputi isolasi DNA, pemotongan
dan penyambungan DNA dan pemasukan DNA ke sel (Pranita et al. 2021). Prosedur
kloning terdiri dari isolasi plasmid DNA yang mengandung sekuens yang
diinginkan, digesti (cutting) plasmid dengan restriction endonuclease,
pemisahan fragmen dengan elektroforesis, pemurnian DNA target, ligasi
(penyambungan) DNA ke plasmid baru untuk membentuk rekombinan baru, transfer
plasmid yang berhasil disambung ke sel (Transformasi), seleksi bakteri yang
berhasil menerima plasmid (Transforman) serta analisis plasmid rekombinan
(Langden et al. 2017).
DNA
atau gen yang akan dimasukkan ke dalam sel inang memerlukan suatu kendaraan
yang disebut dengan vektor. Vektor dapat diartikan sebagai molekul DNA yang
dapat ditempatkan dalam suatu sel dan digunakan sebagai pembawa (carrier) DNA
asing pada sel tersebut. Vektor harus memiliki kemampuan untuk bereplikasi
secara mandiri dalam sel bakteri sehingga tidak perlu diinsersi pada genom
bakteri. Vektor memiliki setidaknya satu selectable marker agar kita
dapat mengidentifikasi keberadaan vektor tersebut dalam sel bakteri. Marka atau penanda selektif (selectable
marker) berfungsi mengidentifikasi sel bakteri yang mengandung plasmid serta
membedakan plasmid yangmengandung hasil kloning suatu DNA asing. Beberapa tipe
vektor yang dapat digunakan yaitu plasmid, lambda phage, cosmid, bacterial
artificial chromosome dan yeast artificial chromosome. Vektor yang
paling banyak digunakan dalam penelitian yaitu dalam bentuk plasmid. Plasmid
dapat diartikan sebagai molekul DNA double-stranded berbentuk sirkuler atau
linear yang dapat bereplikasi secara independent yang ditemukan pada sel
prokariot (Mujayana et al. 2019). Plasmid
mempunyai 3 komponen penting yaitu Origin
of replication(ORI),
sehingga plasmid dapat
bereplikasisecara mandiri, mempunyai
daerah unik sebagai situs pemotongan enzim
endonuclease, yang biasa disebut multiple cloning
site (MCS), dan membawa
penanda seleksi (biasanya resistensi
terhadap antibiotika) untuk membedakan
antara sel inang
yang mengandung plasmid atau tidak (Hardianto et al. 2015).
DNA
tertentu yang akan dimasukkan ke dalam plasmid harus memiliki situs enzim restriksi
yang sama. Enzim restriksi dapat diartikan sebagai enzim yang memotong situs
DNA pada bagian tertentu pada sekuen DNA. DNA dan plasmid yang telah dipotong
pada situs yang sama akan disambungkan menggunakan enzim ligasi dan
ditransformasikan ke dalam bakteri lalu direplikasi dalam media tumbuh
(Purwaningrum et al. 2018).
Penelitian yang dilakukan Novita et al. (2016), gen putative cleavage
protein 1 (PCP-1) dari udang vaname yang terserang Infectious
Myonecrosis Virus berhasil dikloning, berdasarkan hasil isolasi plasmid
cDNA PCP-1 yang menunjukkan semua koloni bakteri terseleksi membawa plasmid
hasil insersi DNA gen PCP–1. Analisis kesejajaran urutan nukleotida menunjukkan
bahwa cDNA dari gen PCP-1 nilai homologinya mencapai 100% dan 99% dengan sekuen
di Genebank yaitu identik dengan sekuen dari Brazil dan Indonesia.
DAFTAR
PUSTAKA
Hardianto D, Indarto A,
Sasongko ND. 2015. Optimasi metode lisis alkali untuk meningkatkan konsentrasi plasmid. Jurnal Bioteknologi
dan Biosains Indonesia 2(2): 60-64.
Langden SSS, Budiharjo A,
Wijanarka, Kusharyoto W. 2017. Transformasi dan kloning plasmid PJ804:77539 pada E. coli top’10. Jurnal
Biologi. 6(1): 65-70.
Mishra N, Khan RH,
Dwivedi B, Mishra SK. 2014. Cloning of gene coding glyceraldehyde 3- phospate dehydrogenase. Asian Journal
of Pharmacy and Technology. 4(4): 184-188.
Mujayana, Nurjanna,
Syakariah M. 2019. Teknik penyiapan vaksin double stranded RNA (dsRNA) VP 15 dengan metode pemanasan bakteri. Buletin
Teknik Litkayasa Akuakultur. 17(2):
137-141.
Novita H, Sunarto A,
Andriyanto S. 2015. Kloning gen putative cleavage protein 1 (PCP-1) pada
udang (Litopenaeus vannamei)
yang terserang infectious myonecrosis virus. Media Akuakultur. 11(1): 27-33.
Pranita NP, Novtarina R, Nugroho RC, Himayani R, Ismunandar H. 2021.
Penerapan Bioteknologi DNA
Rekombinan: Pengembangan Vaksinasi COVID-19. Medical Profession Journal of Lampung.
11(3): 300-305.
Purwaningrum M, Verawati V, Haryanto A. 2018. Deteksi molekuler gen
fusion (F) dan analisis perbandingan
beberapa enzim restriksi sebagai penentu patotipe virus newcastle disease. Jurnal Nasional
Teknologi Terapan. 2(3): 309-320.
Yatera K, Noguchi S, Mukae H. 2021. Perspective on the clone library
method for infectious diseases. Respiratory
Investigation. 59(6): 741-747.
Komentar