Langsung ke konten utama

SINTESIS cDNA

 

SINTESIS cDNA

Akuakultur sebagai  sektor pendukung pangan terbesar di dunia saat ini telah menerapkan pemanfaatkan teknologi biologi molekuler salah satunya Polymerase Chain Reaction (PCR). PCR telah dimanfaatkan untuk berbagai kepentingan seperti identifikasi penyakit dan kekerabatan spesies ikan. Kegunaan PCR untuk mengamplikasi RNA memerlukan proses yang disebut dengan reverse transcriptase terhadap molekul complementary DNA (Cdna) (Hewajuli dan Dharmayanti 2014). Mrna yang merupakan produk transkripsi DNA dapat dideteksi secara sederhana untuk mengetahui tingkat ekspresi suatu gen. Identifikasi mRNA digunakan untuk mengukur tingkat perbedaan ekspresi dari Cdna, seperti gen yang mengekspresikan protein tertentu pada penyakit ikan di lingkungan akuakultur. Deteksi mrna biasanya menggunakan metode PCR yang dikenal dengan nama one step quantitative Real Time- Polymerase Chain Reaction (Qrt-PCR) (Rahman et al. 2013). Metode ini merupakan metode yang memanfaatkan sampel RNA dengan melakukan sintesis cDNA langsung dalam mesin Qrt-PCR dengan kelebihan yang dimiliki yaitu sensitivitas dan spesifitas yang tinggi, akan tetapi metode ini sangat sulit dilakukan karena sifat RNA yang sangat sensitif dan mudah terdegradasi apabila suhu berubah drastis ataupun terjadi kontaminasi yang mengandung enzim RNAse (Kartika 2018).

 cDNA merupakan DNA yang berkomplemen dengan Mrna. cDNA mirip dengan RNA, complementary DNA (Cdna) merupakan RNA dengan rantai ganda yang hanya berisi exon. Perbedaannya yaitu cDNA memiliki sifat yang lebih stabil sehingga mudah untuk dianalisis.  Molekul cDNA digunakan sebagai cetakan dalam proses PCR. Sintesis cDNA dilakukan melalui proses yang dinamakan dengan reverse transcription menambakan enzim reverse transcriptase yang bertujuan untuk menggandakan RNA yang telah diisolasi ke dalam bentuk cDNA. Hasil sintesis cDNA diverifikasi menggunakan nanodrop (Triyaningsih et al. 2022). Enzim reverse transcriptase dapat diartikan sebagai enzim yang secara alami digunakan oleh retrovirus untuk membuat kopi DNA berdasarkan RNA-nya. Result enzyme reverse transcriptae (RT) dapat diartikan sebagai bagian terpenting dari enzim reagen yang banyak digunakan dalam kegiatan molekuler khususnya untuk sintesis cDNA dari mrna. Pemanfaatan enzim ini memberikan pemahaman yang luas mengenai mekanisme regular seluler. Penggunaan enzim reverse transcriptase ketika dipasangkan dengan amplifikasi  PCR akan menjadi standar untuk aktivasi cloning berbagai target yang diinginkan (Saepuloh et al. 2013).

Berdasarkan penelitian yang dilakukan Kasasiah et al. (2017), sebelum dilakukan sintesis cDNA, sampel RNA diberi perlakuan enzim DNAseI menggunakan protokol kit DNAseI (ThermoScientificTM) untuk menghilangkan kontaminasi DNA genom. Kontaminasi DNA genom pada hasil isolasi RNA dapat terlihat pada gel agarosa, ditandai dengan kemunculan pita pada ukuran diatas 10.000 pb. Sampel RNA diberi perlakuan menggunakan DNAse I. Sintesis cDNA dilakukan dengan protokol RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo ScientificTM). 10 μL sampel RNA digunakan sebagai template dan primer oligo (dT)18 untuk sintesis cDNA. Sintesis cDNA dilakukan dengan menggunakan thermal cycler 2720. cDNA yang terbentuk kemudian dikonfirmasi dengan primer mtp dan f-box. Hasil sintesis cDNA disimpan di suhu -20ºC.

DAFTAR PUSTAKA

Hewajuli DA, Dharmayanti NLPI. 2014. Perkembangan teknologi Reverse Transcriptase-           Polymerase Chain Reaction dalam mengidentifikasi genom Avian influenza dan Newcastle       disease. Wartazoa. 24: 16-29.

Kartika AI. 2018. Optimasi annealing temperature primer Mrna RECK metode one step qrt-PCR.       Jurnal Labora Medika. 2(1): 22-31.

Kasasiah A, Sumardi D, Pancoro A. 2017. Pola ekspresi gen pal1, chs7, dan ch1b1 pada tahap pertumbuhan varietas lokal daun kedelai hitam (Glycine max (L). Merr Journal. 1194: 98-   113.

Rahman MT, Uddin MS, Sultana R, Moue A, Setu M. 2013. Polymerase Chain Reaction (PCR):   A short review. Anwer Khan Modern Medical College Journal. 4(1): 30-36.

Saepuloh U, Iskandriati D, Pamungkas J, Sajuthi D. 2013. Ekspresi enzim rekombunan reverse    transcriptase (RT RNAse H) Simian betaretrovirus serotipe-2 asal Macaca fascicularis   Indonesia dalam sistem ekspresi Eschericia coli. Jurnal Ilmu Pertanian Indonesia. 18(2): 49-54.

Triyaningsih, Nuringtyas TR, Purwestri YA, Sebastian A. 2022. Optimasi suhu annealing Qrt-pcr       GEN WRKY45 sebagai deteksi gen ketahanan terhadap infeksi Xanthomonas oryzae pv.      Oryzae pada padi hitam cempo ireng. Jurnal Ilmu Dasar. 23(1): 23-28.

Komentar

Posting Komentar

Postingan populer dari blog ini

Manfaat dan bahaya sayur bayam

        Sayur adalah pangan yang kaya akan zat gizi seperti vitamin,mineral,serat,dan antioksidan. Karena kandungan gizinya yang tinggi, para dokter dan ahli gizi di seluruh dunia menganjurkan masyarakat untuk mengkonsumsi sayuran secara rutin. Selain itu banyak penelitian yang membuktian bahwa mengkonsumsi sayur secara rutin memiliki banyak manfaat bagi kesehatan.    Namun, perlu diketahui bahwa ternyata sayur bayam juga memiliki bahaya bagi kesehatan tubuh lho! 1. SEJARAH SAYUR BAYAM      Sayuran yang memiliki nama ilmiah Amaranthus sp . ini dianggap sebagai raja sayuran karena kandungan gizinya yang tinggi. Bayam berasal dari Amerika Selatan dan Tengah. Bermula dari suku asli meksiko,Aztec,yang telah membudidayakan bayam berjuta tahun lalu. Dikalangan suku tersebut Bayam merupakan tanaman yang penting dari bagian kebudayaan mereka. Bahkan, mereka membuat patung-patung dewa dari adonan bayam,yang akhirnya akan dimakan. Bukan hanya i...
Posting Komentar
Baca selengkapnya

CARA MENDAPATKAN SERTIFIKAT GRATIS DI MASA PANDEMI

 Hai teman-teman,      Pandemi Covid-19 yang belum kunjung mereda membuat banyak masyarakat jenuh. Keterbatasan untuk mengakses hal-hal baru juga hanya bisa dilakukan dirumah melalui online. Keinginan untuk meningkatkan prestasi juga sulit dilakukan diluar rumah.     Terkadang kita sering merasa down  karena melihat prestasi teman-teman kita yang terus berkembang meskipun di masa pandemi. Tidak sedikit mereka mendapatkan E-Certificate . Daripada menghabiskan waktu untuk hal-hal yang tidak berguna, lebih baik kita meningkatkan kemampuan diri kita di masa pandemi. "Hmmm, pasti bayar nih!"     NO!  Sertifikat ini bisa kalian dapatkan dengan gratis lho! Berikut daftar website untuk mengasah kemampuan teman-teman dan mendapatkan sertifikat gratis! 1) Microsoft 365  Teman-teman bisa kunjungi  link berikut untuk mendapatkan sertifikat gratisnya:  Caranya mudah banget, teman-teman cukup mendaftar menggunakan email teman-teman. Se...
1 komentar
Baca selengkapnya

GAYA REMAJA MASA KINI

PENGERTIAN Gaya hidup merupakan gambaran bagi setiap orang yang menggambarkan seberapa besar nilai moralorang tersebut dalam masyarakat di sekitarnya dan bagaimana cara orang tersebut hidup. Sebagian besar remaja zaman sekarang itu menyalahgunakan gaya hidupnya, apalagi remaja-remaja yang hidup di kota metropolitan. Dan bukan hanya orang-orang di kota metropolitan saja yang mengikuti trend mode di zaman sekarang dahkan di perkampungan dan pedesaan pun banyak yang mengikutinya selagi mereka menanggapi hal itu dengan negatif. Remaja zaman kini itu selalu dikaitkan dengan teknologi. Banyak di sekitar kita wanita yang memakai celana pendek di depan umum yang di ajarkan dalam ajaran islam yaitu harus menutup aurat kecuali telapak tangan dan muka bagi seorang wanita yang beragama islam. Sebagian besar mereka lebih mengikuti trendmode di masa kini, seperti contohnya berpakain seperti orang luar negeri dan bergaya kebarat-baratan. Yang kita tahu bahwa trend mode yang ada di luar negeri itu ...
1 komentar
Baca selengkapnya